生產(chǎn)菌株的選育與生物發(fā)酵消泡劑

發(fā)布時間：2012-11-6 10:44

肌苷的生產(chǎn)菌株多為枯草桿菌腺嘌呤缺陷型由于普遍存在著使IMP脫磷酸化的酶類，所以，比較容易得到積累肌苷和次黃嘌呤的突變株。又由于IMP對細胞膜滲透性很差，因此，肌苷生物發(fā)酵消泡劑的發(fā)酵比肌苷酸的生物發(fā)酵消泡劑發(fā)酵來得容易。有人曾研究枯草桿菌嘌呤核苷酸合成中，各種終產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的反饋抑制效果，發(fā)現(xiàn)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶專一性地受AMP, ADP的完全抑制，但受IMP,GMP, XMP和ATP的抑制卻很弱，這是與產(chǎn)氣氣桿菌等的不同點。在GMP的生物合成中，IMP脫氫酶受GMP抑制最強；其次是ATP, XMP, GTP。IMP生物合成酶系和AMP生物合成酶系為腺嘌呤化合物所阻遏。由IMP合成AMP, GMP兩種核苷酸，傾向于優(yōu)先合成GMP。根據(jù)這樣的代謝調(diào)節(jié)機制，使用芽孢桿菌屬的腺嘌呤缺陷型突變株進行肌苷生物發(fā)酵消泡劑的發(fā)酵時，必須在不明顯抑制菌體生長的范圍內(nèi)，盡量降低培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度（保持在不能引起反饋調(diào)節(jié)的濃度），從而有利于肌苷的積累。一步選育不受腺嘌呤系核苷酸代謝控制的突變株，也是增加肌苷積累的重要手段。這些突變株的獲得包括抗代謝類似物，如抗8-AG（8-氮鳥嘌呤），抗8-AX（8-氮雜黃嘌呤）等。值得注意的是：在誘導8-AGr或8-AXr突變株，選育肌苷高產(chǎn)菌株時，使用的出發(fā)菌株應該是喪失腺嘌呤脫氨酶的突變株。這是因為喪失dea，能提高出發(fā)菌株對8-AG或8-AX等類似物的敏感性，易于分離到有效的抗性突變株。假如有dea存在，腺嘌呤就會被脫氨化而轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤，生成的次黃嘌呤能解除8-AX對菌體生長的抑制作用。另外肌苷分解活性低的菌株對積累肌苷有利。 5-IMP的生產(chǎn)菌株的研究主要分為兩種類型由以芽孢桿菌屬細菌誘變的肌苷生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，進一步誘變，選育遺傳性地喪失了生物發(fā)酵消泡劑及降解核苷酸酶活性的突變株，育成IMP生產(chǎn)菌；將產(chǎn)量較低的IMP生產(chǎn)菌用遺傳的方法或通過對其培養(yǎng)條件的研究，加以改良，提高IMP的積累。選育第一類的生產(chǎn)菌時，必須先了解分解IMP成肌苷的酶，這些酶有5'-核苷酸酶、酸性磷酸酯酶及堿性磷酸酯酶等。使用的菌株究竟是含有哪種酶？此酶分布在細胞內(nèi)的位置，然后誘變得到降低酶活的突變株。屬于第二類的微生物有短桿菌屬、棒桿菌屬及鏈霉菌屬等，它們與芽孢桿菌不同，其生物發(fā)酵消泡劑與降解核苷酸的酶活性本來很弱，這些菌株的腺嘌呤缺陷型能積累肌苷酸、次黃嘌呤，而不積累肌苷。以產(chǎn)氨短桿菌為例，對5ˊ-IMP的生物合成來說，關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶受ATP,ADP,AMP及GMP的反饋抑制（抑制度為70%-100%）。被腺嘌呤阻遏，GMP和AMP是一種協(xié)同反饋抑制，當出現(xiàn)腺嘌呤或AMP缺陷型突變株時（喪失SAMP合成酶），在腺嘌呤亞適量下，該酶抑制即被解除。而IMP-XMP的IMP脫氫酶受鳥嘌呤的阻遏和GMP的抑制，因而積累IMP。同理，當出現(xiàn)鳥嘌呤或GMP缺陷突變株時亦能積累IMP。如在具有喪失SAMP合成酶遺傳標記的基礎(chǔ)上，能再設法增加喪失IMP脫氫酶的標記，即成為腺嘌呤和黃嘌呤缺陷型，IMP產(chǎn)量顯著提高。腺苷和5ˊ-腺苷酸的生產(chǎn)菌株選育曾報道有這樣兩種異亮氨酸缺陷型菌株，培養(yǎng)基中異亮氨酸添加濃度控制在0.2-0.3mg／ml為宜，關(guān)于異亮氨酸缺陷與腺苷積累的關(guān)系，目前尚未搞清；②黃嘌呤和鳥嘌呤雙重缺陷型菌株。 5ˊ鳥嘌呤的制造方法 ①利用微生物友酵法生產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸，然后化學法制成GMP；②生物發(fā)酵消泡劑的發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷，然后以酶法或化學法進行磷酸化得到GMP；③利用XMP或黃苷生產(chǎn)菌與能將XMP或黃苷轉(zhuǎn)化為GMP的菌株混合培養(yǎng)生產(chǎn)GMP；④直接生物發(fā)酵消泡劑的發(fā)酵法生產(chǎn)GMP。目前①和②用于工業(yè)生產(chǎn)。直接生物發(fā)酵消泡劑的發(fā)酵生產(chǎn)GMP，必須具備如下條件：①應當解除GMP生物合成的調(diào)節(jié)機制，首先要設法解除GMP對IMP脫氫酶的終產(chǎn)物抑制作用；②由于GMP與IMP一樣難于透過細胞膜，所以在解除反饋抑制前提下，還應設法改善細胞膜滲透性；③不分解生成的GMP。本文參考《發(fā)酵微生物學》一書。

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