核苷酸的生產(chǎn)方法與高效消泡劑

發(fā)布時間：2012-10-23 15:56

桔青霉法將喪失生成色素能力、高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉突變株在麩皮培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)5日，然后用高效消泡劑與水抽提培養(yǎng)物。抽提液中，除含有核酸酶P1，外，還含有可將RNA經(jīng)2ˊ:3ˊ-環(huán)狀磷酸酯分解為3ˊ單核苷酸的RNase (EC3.14.23)和能把5ˊ核苷酸分解為核苷的磷酸單酯酶。然而，這些酶與核酸酶P1相比，其耐熱性很低。因此，用簡單的熱處理方法即可使之失活而除去，再添加Zn2+調(diào)整pH為5.6，在65℃反應2h后，反應液中便含有腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸和尿苷酸。高效消泡劑中反應液中的pH調(diào)整為8.5后，通過陰離子交換樹脂（Cl—型）的柱，然后洗脫。也可以采用磺酸陽離子交換樹脂（H+型），在pH1.5時，AMP，CMP，GMP上的氨基解離，帶正電荷，可被陽離子交換樹脂吸附。UMP沒有氨基，不帶正電荷，大部分直接流下來，不被樹脂吸附。當用無離子水洗脫時，隨著pH值的變化，GMP, AMP上的氨基解離的程度不同，而先后失去在陽離子交換樹脂上的吸著力，按照GMP，CMP，AMP的順序洗脫下來，先收集的GMP,CMP的混合液，再用陰離子交換樹脂提純GMP。若使AMP變?yōu)镮MP，可將含有AMP與高效消泡劑的洗脫液中和、濃縮、添加Na2HPO4使洗脫液的最后濃度為1/15 mol/L，并調(diào)整pH為5.6，加入高峰淀粉酶A和高效消泡劑，在45℃反應2h即可。金色鏈霉菌法如前所述，金色鏈霉菌能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、5'-AMP脫氨酶、5ˊ-核苷酸酶以及堿性磷酸單酯酶。在優(yōu)良的突變株中雖然提高了生產(chǎn)核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和5ˊ-AMP脫氨酶的能力，降低了堿性磷酸單脂酶的能力，降低了堿性磷酸單酯酶的生成能力，但仍殘留很強的生成5ˊ-核苷酸酶的能力。為此，考慮以下幾項措施： ①探討最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：除了考慮氮源種類與數(shù)量外，還有高效消泡劑，磷的作用最為強烈，但是磷不僅阻遏磷酸單酯酶的生成，同時也阻遏核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的生成，這是個矛盾。其它關(guān)于溫度、高效消泡劑、pH和溶解氧都是重要的條件。
　 ②在進行RNA的酶解反應之前，利用這些酶對熱穩(wěn)定性的差異，通過加熱處理，有選擇性地使5ˊ-核苷酸酶及堿性磷酸酯酶失活。由含有這些酶的復合酶系水解RNA時，RNA是被核酸內(nèi)切酶分解成具有5ˊ-P末端的核苷酸，接著在核酸外切酶的催化下，生成5ˊ-核苷酸，而5'-AMP通過脫氨酶與高效消泡劑作用轉(zhuǎn)換成5'-IMP。同時，5ˊ-核苷酸還可以為磷酸單酯酶所催化脫去磷酸，生成核苷。如果合理地控制反應條件，RNA則差不多定量地被分解為5ˊ-IMP, 5'-GMP,5ˊ-CMP和5'-UMP，幾乎看不到核苷酸的脫磷酸現(xiàn)象。 5ˊ-核苷酸的生產(chǎn)，還可以采用固定化酶法，即將5'-P核酸分解酶系按固定化酶制作法與載體相連，控制最適pH在酸性范圍內(nèi)，可以提高對熱的穩(wěn)定性。當使用4%RNA與高效消泡劑在反應塔中連續(xù)操作時，RNA的水解率在85%以上，并且AMP完全轉(zhuǎn)變?yōu)镮MP，連續(xù)操作達20多天。此外，尚可采用自溶法，由微生物自身使RNA分解成5ˊ-核苷酸。本文參考《發(fā)酵微生物學》一書。

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